Publisher

National Public Health Institute

Väitöskirja-artikkeli: Apua ruokamyrkytysten selvittämiseen

Kansanterveyden ja elintarviketurvallisuuden kannalta on erittäin tärkeää, että ruokamyrkytysten aiheuttajat löydetään ja niiden tartuntareitit selvitetään. Tähän tarvitaan mikrobiologisten tutkimusmenetelmien kehittämistä. Sitä kautta pyritään saamaan lisäinformaatiota ruokamyrkytysbakteerien ominaisuuksista ja havaitsemaan tai jopa ehkäisemään alkavat epidemiat. Väitöskirjatyössä tyypitettiin ruokamyrkytysepidemioita aiheuttavia Salmonella enterica, Listeria monocytogenes ja Clostridium perfringens -bakteereja perinteisillä ja geneettisillä tyypitysmenetelmillä.

Vuosittain arviolta puoli miljoonaa suomalaista sairastuu mikrobien eli pieneliöiden aiheuttamaan ruokamyrkytykseen tai tartuntatautiin. Usealle tuhannelle tartunnasta aiheutuu hankalia jälkioireita. Sosiaali-ja terveysministeriön työryhmän arvion mukaan sairastumisista koituvat vuosikustannukset nousevat lähes 85 miljoonaan euroon. Silti vain pieni osa näistä ruoan tai juomaveden välityksellä leviävistä mikrobeista pystytään jäljittämään tiettyyn tartunnanlähteeseen. Mikrobien ulkoisia ominaisuuksia tunnistavat perinteiset fenotyypitysmenetelmät eivät useinkaan anna riittävää informaatiota epidemiologisiin tarkoituksiin. Mikrobien perintöainesta tunnistavat uudet molekyyligeneettiset tyypitysmenetelmät ovat tarjonneet tähän erinomaisen apukeinon. Mikrobien tarkka tyypitys luo perustan myös ruokamyrkytysepidemioiden tehokkaalle ehkäisylle.

Väitöskirjatyössä tutkimuksen kohteena olivat Salmonella enterica-, Listeria monocytogenes- ja Clostridium perfringens-bakteerit, jotka ovat kansanterveydellisesti merkittäviä elintarvikevälitteisiä taudinaiheuttajia.

Salmonella Enteritidis FT1 ja FT4 -epidemiat 1990-luvulla

Yleisvaarallista tartuntatautia aiheuttava S. enterica serotyyppi Enteritidis (alatyyppi FT1 ja FT4) aiheutti Suomessa 1990-luvun alussa 12 epidemiaa, joissa sairastui lähes 600 henkilöä. Näiden epidemioiden tartuntalähde jäi kuitenkin epäselväksi.

Väitöskirjatutkimuksen myötä aiemmat epäilyt varmistuivat ja S. Enteritidis FT1 -kanta, joka oli aiheuttanut epidemioita Turussa ja Vieremällä 1991-95 oli lähtöisin turkulaisesta tuotantokanalasta. Sen sijaan geneettisellä tyypitykselläkään ei löytynyt perusteluita epäilyille, joiden mukaan kyseisen kanalan salmonellakanta olisi peräisin Baltian maista. Siellä kyseinen faagityyppi FT1 on yleinen ”kananmunasalmonelloosin” aiheuttaja. Osoittautui myös, että kolme S. Enteritidis FT4 -kantaa, jotka olivat aiheuttaneet epidemiat Leppävirralla, Kotkassa ja Raumalla vuosina 1994 ja 1995, olivat eri tartuntalähteistä. Tämän lisäksi saatiin tärkeää tietoa salmonellakannoista, jotka on eristetty tuotantoeläimistä sekä suomalaisista turisteista, joiden sairastumista on edeltänyt ulkomaanmatka.

Listeria monocytogenes-infektioryppäiden havaitseminen

L. monocytogenes-bakteerin aiheuttama listerioosi on niin sanottu ilmoitettava tartuntatauti ja siinä kuolleisuus on jopa 20–30 prosenttia. Tämä lisää tarkan epidemiologisen seurannan tarvetta. Tutkimus osoitti, että lähes kaikki Suomen listerioositapauksien aiheuttajat 1990-luvun alusta vuoteen 2001 kuuluivat vain kahteen serotyyppiin (1/2a ja 4b) ja serotyyppi 1/2a on syrjäyttämässä serotyypin 4b. L. monocytogenes-kantojen yleisin yksittäinen pulssikenttäelektroforeesilla (PFGE) tyypitetty genotyyppi oli PFGE tyyppi 1, joka on aiemmin yhdistetty muun muassa vakuumipakattuihin kalatuotteisiin. Lisäksi tuli esille, että serotyyppin 3a aiheuttama voiepidemia alkoi jo vuonna 1997. Kaksi muuta mielenkiintoista havaintoa olivat PFGE-tyypin 24 tilastollisesti merkitsevä liittyminen miespuolisille potilaille listerioosin aiheuttaneisiin kantoihin sekä se että neljäsosa elintarviketeollisuudessa eristettyjen kantojen genotyypeistä ei ollut ihmisistä eristettyjen kantojen genotyyppien joukossa.

Automaattinen ribotyypitys on hyvin käyttökelpoinen tyypitysmenetelmä epidemiatilanteessa, sillä se kykenee käsittelemään suuria näytemääriä lyhyessä ajassa minimaalisella työmäärällä. Kuitenkaan ribotyypitys EcoRI-entsyymillä ei lisännyt erottelukykyä, kun sen tyypitystulokset yhdistettiin PFGE:llä saatuihin tuloksiin. Ilman serotyypitystä ribotyypitys EcoRI:llä ei myöskään ollut tarpeeksi erotteleva tutkittaessa Suomen voiepidemiakantoja, jotka olivat harvinaista serotyyppiä 3a.

Elektroninen genotyyppikirjasto

Ihmisistä eristettyjen L. monocytogenes bakteerikantojen pulssikenttäelektroforeesilla saaduista genotyyppiprofiileista luotiin elektroninen kirjasto Kansanterveyslaitoksen (KTL) suolistobakteriologian laboratorioon. Tämä kirjasto on jokapäiväisessä käytössä helpottaen tartuntaryppäiden toteamista. PFGE-tyypityksen yhdenmukaistamisen myötä sähköinen kirjasto mahdollistaa PFGE-profiilien lähettämisen ja vertailun sähköisen tietoverkon välityksellä KTL:n suolistobakteriologian laboratorion ja Eläinlääkintä- ja elintarviketutkimuslaitoksen (EELA) välillä. Tällainen yhteistyö elintarvikenäytteitä tutkivan osapuolen kanssa nopeuttaa tartuntoja aiheuttaneiden elintarvikkeiden tunnistamista ja jouduttaa epidemioiden selvittämistä, kun samaa näytettä ei tarvitse analysoida kahdessa eri paikassa.

Clostridium perfringens -epidemioiden tunnistus luotettavammaksi

C. perfringens -bakteerien aiheuttamien ruokamyrkytysten tunnistusta vaikeuttaa se, että C. perfringens -bakteeria esiintyy lähes kaikkien ihmisten suolistossa ns. normaalikasvustona. Ruokamyrkytyksiä aiheuttavilla C. perfringens -kannoilla on kuitenkin normaalikasvuston kannoista poiketen cpe-geeni, joka määrää ruokamyrkytyksen suolisto-oireita aiheuttavan enterotoksiinin tuotantoa potilaan suolistossa. Kun Suomessa on epäilty C. perfringens -bakteerin aiheuttaneen epidemian, lopullinen diagnoosi on aiemmin useimmiten perustunut vain potilaan kliinisiin oireisiin ja/tai löydöksiin ruuissa eikä potilaan ulostenäytettä ole yleensä tutkittu.

Väitöskirjatutkimuksessa selvisi, että kahden epidemiaryppään C. perfringens -kannat eivät olleet aiheuttaneet epidemiaa, vaikka näin oli aiemmin epäilty. Tämä osoittaa selvästi, että eristettyjen C. perfringens -isolaattien tunnistus täytyy tehdä tarkemmin kuin lajitasolla. Lisäksi todettiin, että PFGE-tyypitys tai enterotoksiinin tuoton määrittäminen yksinään voi johtaa väärään negatiiviseen tulokseen, joten enterotoksiinia määräävä cpe-geenin toteaminen PCR:llä on tarpeellista. Näin ruokamyrkytyksiä aiheuttavien C. perfringens -bakteereiden tunnistus on luotettavampaa. On myös tärkeää tutkia ulosteviljelymaljalta useampia pesäkkeitä. Tällöin on suurempi mahdollisuus havaita bakteerisoluja, joilla on cpe-geeni. Tämän tutkimuksen tuloksena Suomen kliinisen mikrobiologian laboratorioille on annettu suositus poimia jatkotutkimuksia varten viljelymaljalta kymmenen C. perfringens -pesäkettä epidemiaa kohti.

PFGE epidemiologisissa tutkimuksissa

Bakteerien DNA:ta pilkkova pulssikenttäelektroforeesimenetelmä eli PFGE sopi parhaiten epidemiologisiin tutkimuksiin ja täydensi perinteisillä fenotyypitysmenetelmillä saatuja epidemioiden jäljitystuloksia. On kuitenkin huomattava, että ilman perinteistä spesifistä fenotyypitystietoa PFGE ei ole aina riittävä erottelemaan joitakin S. Enteritidis FT1 ja FT4 -kantoja toisistaan tai patogeenisia C. perfringens -kantoja suoliston normaalikasvuston ei-patogeenisista C. perfringens -kannoista. Ennen pidemmälle meneviä lisätyypityksiä, esimerkiksi PFGE-tyypitystä, on tämän vuoksi erittäin tärkeää faagityypittää kaikki S. Enteritidis -kannat ja määrittää, onko kaikilla tutkittavilla C. perfringens -kannoilla cpe-geeni. Tulkittaessa PFGE-tyypitystuloksia on lisäksi hyvä tietää erityisesti L. monocytogenes -kantojen epidemiologinen tausta.

Joskus PFGE-tyypityksen aikana DNA pilkkoutuu, jolloin kannan PFGE genotyypitys on mahdotonta. Aiemmissa tutkimuksissa DNA:n pilkkoutumista on yritetty estää lisäämällä thioureaa normaaliin ajopuskuriin. Koska thiourea on kuitenkin syöpää aiheuttava aine, sitä ei haluttu käyttää. Ongelma saatiin poistettua muuttamalla Tris:iä sisältävä ajopuskuri HEPES-puskuriin, jolloin kaikki aiemmin tyypittymättömät S. Ohio, S. Newport ja enterohaemorrhaginen E.coli non-O157 bakteerikannat saatiin tyypitettyä.

Tutkimus luo metodisen kehittelyn kautta parempia mahdollisuuksia bakteerien tarkempaan, luotettavampaan ja nopeampaan analysointiin. Lisäksi väitöskirjatyö mahdollistaa entistä toimivamman informaatiotiedoston kokoamisen ja on näin askel kohti entistä verkottuneempaa kotimaista ja kansainvälistä yhteistyötä.

Susanna Lukinmaa KTL, Mikrobiologian osasto susanna.lukinmaa@ktl.fi

Tiivistelmä väitöskirjasta: Susanna Lukinmaa. Salmonella enterica, Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens: Diversity of Human Isolates Studied by Phenotypic and Molecular Methods.

Publications of National Public Health Institute A18/2003. www.ktl.fi/julkaisut/asarja.html.